Effetto della supplementazione di Gluconato di calcio rumino-protetto con una matrice di grasso idrogenato sui parametri digestivi, metabolici e produttivi in vacche in lattazione.

Abstract

Alcune recenti ricerche scientifiche nel campo della nutrizione e del metabolismo della vacca da latte, stanno focalizzando l’attenzione su un distretto anatomico ancora poco studiato fino ad ora come il grosso intestino. Le evidenze che emergono da queste pubblicazioni suggeriscono come il miglioramento della salute e dell’integrità della barriera intestinale abbiano un effetto importante sulla ripartizione energetica. In altre parole, con un intestino in salute, una minor quota di energia verrà richiesta per il controllo del fenomeno dell’attivazione immunitaria” risparmiando risorse che potranno quindi essere dirette per scopi produttivi.

L’acido gluconico e i suoi sali hanno mostrato in passato effetti prebiotici nel tratto inferiore dell’intestino dei monogastrici, dove si comportano come precursori del butirrato. Il butirrato ed i suoi precursori, nonostante le evidenze scientifiche nei ruminanti siano limitate, hanno dimostrato molteplici effetti benefici sull’ecologia, la morfologia e la funzione del tratto gastrointestinale, agendo come stimolante della proliferazione delle cellule della mucosa intestinale e il consolidamento della barriera intestinale.

Con questo studio il dipartimento di ricerca e sviluppo di Trouw Nutrition si prefigge l’obiettivo di valutare i cambiamenti in termini di produzione di latte, composizione degli acidi grassi, parametri fecali ed ematici in vacche da latte sottoposte a trattamento con Calcio gluconato rumino-protetto con una matrice di Acidi grassi (HFCG) prodotto con una tecnica particolare che garantisce al principio attivo di raggiungere intatto il grosso intestino ed esercitare la sua funzione prebiotica nel grosso intestino. In aggiunta, sono stati considerati anche gli effetti della somministrazione del Calcio Gluconato tramite due tipi diversi di mangime, uno sfarinato ed un pellet estruso, per valutare l’effetto del trattamento di estrusione sull’efficacia del prodotto. Quarantacinque vacche di razza Holstein sono state arruolate nello studio in fase produttiva intorno ai 165 giorni di lattazione utilizzando lo schema sperimentale del quadrato latino 3X3 e son state osservate per un periodo di 28 giorni.

In questo periodo, agli animali è stata somministrata una dieta base integrata con 3 tipi differenti di mangime: un controllo negativo in forma sfarinata senza HFCG, e 2 mangimi contenenti HFCG al dosaggio di 16 gr/capo, uno in forma sfarinata e l’altro in pellet estruso. L’aggiunta di HFCG nella dieta delle bovine da latte permette di aumentare la produzione di latte e di grasso nel latte aumentando di conseguenza la produzione di latte ECM. La produzione totale e la concentrazione di acidi grassi a catena lunga (≥18 atomi di carbonio) nel latte tende ad aumentare in risposta al trattamento con HFCG. I NEFA presenti nel plasma e l’urea nel latte, hanno registrato un aumento negli animali trattati.

Nessuna differenza è stata invece osservata sul pH fecale e sulla concentrazione di acidi grassi volatili, con l’eccezione dell’isobutirrato che invece diminuiva nelle feci degli animali trattati. I cambiamenti evidenziati nel profilo degli acidi grassi suggeriscono che l’aumento della produzione di grasso del latte sia dato in particolare da acidi grassi preformati, supportati dall’incremento dei NEFA circolanti.

Le ricerche future dovranno chiarire meglio le modalità di azione del Calcio gluconato a livello della mucosa del grosso intestino, oltre a indagare sul perché le risposte avute sui parametri fecali degli animali trattati con HFCG sono state inferiori alle attese.

Introduzione e basi scientifiche dell’acidosi intestinale (intestino permeabile)

Come recentemente rivisto da Sanz-Fernandez et al.(2020),il grosso intestino è suscettibile all’acidosi, proprio come il rumine; tuttavia, a causa di una serie di fattori fisiologici e differenze strutturali, risulta meno capace di tollerare la presenza di acidosi rispetto al rumine, con conseguente maggiore permeabilità della mucosa ai composti xenobiotici, come ad esempio le tossine lipopolisaccaridiche (LPS). Questo fenomeno porta ad un aumento della domanda energetica per sostenere l’attivazione della risposta immunitaria (Fox et al., 2005; Kvidera et al., 2017).

Il gluconato di calcio agisce come un prebiotico nei monogastrici, passando attraverso lo stomaco e l’intestino tenue con digestione e assorbimento minimi, arrivando così ad essere utilizzato come substrato di fermentazione dai batteri del grosso intestino, e contribuire in maniera efficace al miglioramento delle prestazioni produttive (Biagi et al.2006; Poeikhampha e Bunchasak, 2011; Michiels et al., 2020). Si pensa che questa associazione tra la somministrazione di prebiotici e le performance produttive degli animali sia mediata da cambiamenti nella produzione microbica di AGV a livello del grosso intestino (Tsukahara et al., 2002, 2006; Biagi et al., 2006).

Gli effetti benefici degli AGV sulla salute intestinale sono ampiamente riconosciuti. L’aumento della disponibilità di AGV (Velazquez et al., 1997; Hamer et al., 2008), e in particolare di butirrato (Sakata e Tamate, 1978; Galfi et al., 1991; Mentschel et al., 2001), induce la proliferazione delle cellule della mucosa intestinale nei modelli animali non ruminanti.

Il butirrato supporta inoltre l’omeostasi delle cellule del tratto gastrointestinale, modulando l’equilibrio tra i fenomeni di proliferazione, apoptosi e differenziazione cellulare, stimolando al contempo anche il microcircolo (Kristensen and Harmon, 2004; Hamer et al., 2008).

Gli effetti della supplementazione di butirrato ruminale sono ben documentati (Huhtanen et al., 1993; Miettinen e Huhtanen, 1996; Herrick et al., 2018), così come gli effetti del butirrato nei monogastrici (Biagi et al.,2006; Poeikhampha e Bunchasak, 2011; Michiels et al., 2020). Tuttavia, mancano informazioni sugli effetti del butirrato nel grosso intestino dei ruminanti, più specificatamente nella vacca da latte, di conseguenza non è ancora ben definito il suo esatto meccanismo d’azione a livello intestinale (come recensito da den Besten et al., 2013; Liu et al., 2018).

Dalle precedenti riflessioni si evince come ci possano essere potenziali vantaggi nell’impiego di Calcio Gluconato rumino-protetto. L’infusione post-ruminale di calcio gluconato, ha portato a cambiamenti nel profilo AGV fecali e ad un aumento del titolo di grasso nelle vacche da latte in lattazione (Doelman et al., 2019b; McKnight et al., 2019). In un recente studio pilota condotto dal nostro gruppo, la somministrazione di calcio gluconato rumino-protetto (HFCG) in vacche da latte nelle prime fasi di lattazione, hanno aumentato sia la concentrazione che la produzione di grasso nel latte. (Doelman et al., 2019a). Un risultato in contrasto con la risposta negativa osservata nella precedente esperienza quando il gluconato di calcio venne somministrato senza rumino-protezione (McKnightet al., 2019). Questo suggerisce che la matrice di grasso idrogenato offre un certo grado di protezione al calcio gluconato dalla degradazione ruminale (Papas e Wu, 1997; Wu et al., 2012), e successivamente la sua digestione nell’intestino tenue, consente al principio attivo di essere liberato e disponibile per la fermentazione nel grosso intestino. 

L’obiettivo del presente studio era quello di testare l’efficacia della supplementazione di calcio gluconato rumino-protetto in una matrice di grasso idrogenato sulla produzione di latte, il profilo degli acidi grassi del latte, la composizione degli AGV a livello fecale, e la misurazione di alcuni metaboliti a livello plasmatico nelle vacche in lattazione.

Inoltre, sono stati testati 2 metodi di somministrazione del gluconato di calcio (incorporandolo sia in mangime sfarinato che in mangime pellettato) per valutare eventuali effetti che i processi di lavorazione del mangime potrebbero avere sulla stabilità del principio attivo, in particolare per quanto concerne la pellettatura e le alte temperature. Abbiamo ipotizzato che l’integrazione nelle diete delle vacche da latte con calcio gluconato ruminoprotetto (HFCG) comporterebbe un aumento di produzione e di titolo del grasso nel latte rispetto al gruppo controllo, indipendentemente dai due metodi di somministrazione.

Materiali e metodi

Questo studio è stato condotto presso il Centro ricerca vacche da latte di Trouw Nutrition

(Boxmeer, Paesi Bassi) tra aprile e giugno 2016. Lo studio ha rispettato la legge olandese sugli esperimenti sugli animali, che è conforme alla Direttiva Europea 2010/63/UE, ed è stato approvato dall’autorità competente, la Centrale Commissie Dierproeven.

Alimentazione e gestione 

Per la durata dello studio gli animali sono stati alloggiati in gruppo a stabulazione libera. L’alimentazione e l’accesso all’acqua erano a volontà. La dieta era somministrata attraverso una miscela unifeed e l’ingestione individuale di alimento veniva monitorata giornalmente grazie a all’utilizzo di mangiatoie elettroniche (RIC system; Hokofarm Group B.V.). La razione di base consisteva in Silomais, siloerba, fieno e mangime complementare formulato per veicolare il calcio Gluconato e garantire un corretto apporto proteico nella razione intorno al 15,4% sulla sostanza secca.

Disegno Sperimentale

In base agli studi precedenti e alle aspettative sui risultati, sono state arruolate per lo studio 45 vacche Frisone-Holstein in lattazione (165 ± 53 GIM all’inizio dello studio) utilizzando il metodo sperimentale a Quadrato Latino 3×3 caratterizzato da 3 repliche della durata di 28 giorni.

Le vacche pluripare (n=31) sono state raggruppate per numero di parti, medie di produzione di latte e contenuto in grasso e proteine riferiti alle lattazioni precedenti. 

Le primipare (n=14), invece, sono state raggruppate sulla base di valutazioni effettuate su base genetica delle aspettative di produzione.

I trattamenti consistevano in un gruppo di animali che assumevano un mangime in farina senza supplemento che rappresentava il controllo negativo, e 2 gruppi trattati col supplemento calcio gluconato rumino-protetto HFCG (Trouw Nutrition), uno con un mangime in farina e l’altro tramite un pellet estruso. L’additivo HFCG era composto dal 50% grasso di palma idrogenato, 40% calcio gluconato, 10% di carbonato di calcio, ed è stato incorporato nel mangime composto con un tasso di inclusione di 1,93 kg/t, corrispondente a circa 16 g di supplemento per capo al giorno, fornendo 6,40 g di gluconato di calcio considerando un’ingestione target di 22,31 kg di sostanza secca capo/giorno. Tutti gli animali hanno iniziato il trattamento lo stesso giorno.

Campioni di feci e sangue

I campioni di sangue sono stati raccolti 2 volte a distanza di 5 ore, e al giorno 28 di trattamento.

Sono stati prelevati anche campioni di plasma con le stesse modalità e, dopo una fase di stoccaggio in congelatore, sono stati analizzati da Masterlab per determinare la concentrazione dei seguenti parametri: acido acetico, glucosio, acidi grassi non esterificati (NEFA), BHB, trigliceridi, insulina, colesterolo, e ormone della crescita (GH).

Al giorno 28 di ogni periodo sono state prelevate anche 150-200 gr di feci fresche raccolte direttamente dal retto per determinare: sostanza secca, pH a contenuto di AGV.

Campioni di latte

Gli animali sono stati munti due volte al giorno alle 05:00 e alle 17:00. Le rese di latte sono state registrate automaticamente ad ogni mungitura. Il latte è stato campionato il martedì, il giovedì mattina, lunedì e mercoledì sera tra il giorno 25 e il giorno 28 di ciascun periodo sperimentale.

I campioni sono stati analizzati per la concentrazione di grasso, proteina, lattosio e urea.

Ulteriori campioni di latte sono stati raccolti per la determinazione del contenuto di acidi grassi nel latte, creando un pool di campioni tra i vari animali appartenenti al gruppo trattato, in cui si è cercato di valutare il valore medio di acidi grassi del latte.

Risultati

Contenuto Fecale AGV e pH

Per quanto riguarda il contenuto fecale di AGV, non si sono osservate differenze significative tra i due gruppi trattati specialmente per la concentrazione di acetato, propionato o butirrato. La concentrazione di isobutirrato è invece calata (~15%; P ≤ 0.001) in risposta al trattamento con HFCG.

Tabella 3. Concentrazione dei metaboliti plasmatici in risposta alla somministrazione di calcio gluconato rumino-protetto (HFCG) in mangime farina o pellet (n = 45)

  1. I valori sono espressi in mmol/L a meno di altre indicazioni.
  2. errore standard della differenza.
  3. HFCG = Gruppo trattato con Calcio gluconato rumino-protetto; Lavorazione = farina vs pellet.

Metaboliti plasmatici

Il livello di alcuni parametri plasmatici è presentato in tabella 3. La concentrazione di NEFA (acidi grassi non esterificati) è aumentata in maniera significativa (40.0%; P= 0.003, mentre il livello di BHB tende a diminuire (4.4%; P =

0.116) in risposta alla supplementazione di calcio gluconato rumino-protetto. Inoltre, il BHB era il 6.5% più elevato (P = 0.046) negli animali alimentati con mangime in farina rispetto al pellet. La concentrazione di glucosio era più elevata negli animali che assumevano mangime in pellet (P = 0.033) rispetto al gruppo alimentato con mangime in farina. 

Risultati produttivi

Le performance di produzione (presentate in tabella 4) dimostrano come la produzione di grasso nel latte tende ad aumentare di 35 gr/giorno (2.4%; P = 0.062) in risposta alla supplementazione con calcio gluconato rumino-protetto, favorendo di conseguenza anche la produzione di latte ECM (1.8%; P = 0.086). Non è stato osservato nessun effetto sul peso vivo degli animali trattati con Calcio Gluconato rumino-protetto.

Tabella 4.  Ingestione di sostanza secca, produzione di latte e composizione peso vivo in risposta alla supplementazione con calcio gluconato ruminoprotetto (HFCG) somministrato con mangime in pellet o farina (n = 45)

  1. I valori sono espressi in kg/d a meno di altre indicazioni.
  2. errore standard della differenza.
  3. HFCG = Gruppo trattato con Calcio gluconato rumino-protetto; Lavorazione= farina vs pellet.
  4. 4% latte FCM: 0.4 × produzione latte (kg/d) + 15 × produzione grasso (kg/d).
  5. produzione latte ECM: 0.01 × produzione latte (kg/d) + 12.2 × produzione grrasso (kg/d) + 7.7 × produzione proteina (kg/d) + 5.3 × produzione lattosio (kg/d).
  6. produzione latte ECM (kg/d):DMI (kg/d).

Profilo acidi grassi del latte

Per quanto riguarda la concentrazione degli acidi grassi del latte si può evidenziare l’aumento del contenuto di acidi grassi preformati (2,08%; P = 0,073) in risposta alla supplementazione di acido gluconato rumino-protetto HFCG.

Quando confrontiamo le varie frazioni di acidi grassi, emerge come la quota totale di acidi grassi preformati tende ad aumentare fino ad un valore di 30,9 g/d (3,9%; P = 0.099) in riposta al trattamento con acido gluconico rumino-protetto (HFCG).

Discussione

La supplementazione di calcio gluconato rumino-protetto (HFCG) ha permesso quindi di aumentare la produzione di grasso nel latte e di conseguenza la produzione di latte ECM. Questi risultati sono allineati con le evidenze dimostrate nei precedenti lavori in cui il calcio gluconato veniva infuso a livello post-ruminale sperimentalmente (Doelman et al. 2019b).

È stato inoltre dimostrato che, una volta incorporato il calcio gluconato rumino-protetto direttamente nella dieta, la digestione della matrice lipidica di protezione avviene nel piccolo intestino favorendo così la liberazione del sale di calcio gluconato che sarà in grado di raggiungere il grosso intestino dove potrà esplicare la sua funzione prebiotica. La risposta produttiva che è stata verificata è infatti da imputare alla fermentazione post-ruminale del calcio gluconato nel grosso intestino. Oltre al significativo aumento del tenore di grasso totale nel latte, è stato anche evidenziato un cambiamento del profilo degli acidi grassi.

Gli acidi grassi con meno di 14 atomi di carbonio evidenziati nel latte venivano formati da sintesi ex novo nell’organismo, mentre quelli con un numero maggiore di 18 atomi di carbonio erano di origine extra mammaria in particolare dalle riserve corporee (Grummer, 1991; Garnsworthy et al., 2006). 

I cambiamenti evidenziati nel contenuto dei vari acidi grassi nel latte suggerisce un sostanziale spostamento dell’equilibrio da acidi grassi di nuova sintesi (cala la concentrazione dei C14-C8) verso un aumento degli acidi grassi preformati di origine extra mammaria, testimoniato dall’aumento della concentrazione di acidi grassi a catena lunga (C≥18).

Tale ipotesi è supportata anche dal concomitante innalzamento della concentrazione dei NEFA nel plasma che forniscono il substrato essenziale per permettere l’incorporazione di acidi grassi preformati nel latte.

Risulta interessante come l’acidosi intestinale, unita a disfunzioni della parete intestinale, possa portare in maniera consistente al calo del tenore di grasso nel latte, specie per quanto riguarda i C18 (Reynolds et al.,2001; Gressley and Armentano, 2005, 2007). C’è da dire che comunque il meccanismo che sottostà ad una tale evidenza rimane sconosciuto. 

La maggior produzione di grasso nel latte osservata può essere spiegata parzialmente dall’incremento di produzione di AGV da parte dei batteri del grosso intestino, in risposta alla supplementazione di calcio gluconato rumino-protetto, anche senza osservare differenze significative sulle concentrazioni dei vari acidi (acetato propionato e butirrato) a livello fecale. Questi dati concordano con i risultati di Doelman et al. (2019a) e probabilmente si spiegano con il veloce assorbimento degli AGV da parte dell’epitelio intestinale scoraggiando così l’ipotesi per cui la misurazione del valore di AGV fecali possa essere considerato un buon marker per l’identificazione di uno stato di acidosi intestinale. (den Besten et al.,2013). 

È comunque possibile stimare in vitro l’aumento della produzione di AGV a livello del grosso intestino in risposta alla supplementazione con calcio gluconato rumino-protetto, (Tsukahara et al. 2002) calcolando in particolare la conversione molare del calcio gluconato a butirrato una volta fermentato dalla microflora ruminale (26% di conversione molare Tsukahara et al. (2002). 

In base alle conoscenze sin qui esposte, ci si attende quindi che una buona parte del calcio gluconato rumino-protetto (HFCG) somministrato a 16 gr/capo/giorno sia fermentato in una significativa quota di butirrato (approssimativamente ~709 mg/giorno).

Questo metabolita gioca un ruolo fondamentale, oltre che nell’aumentare il trofismo delle cellule della mucosa del grosso intestino, anche nei cambiamenti che avvengono nelle varie frazioni degli acidi grassi nel latte, fungendo inizialmente da substrato per l’allungamento delle molecole degli acidi grassi almeno nel 50% di quelli di nuova sintesi.

È possibile presumere che il 50% degli acidi grassi C16 derivi da sintesi ex-novo (Palmquist et al., 1969; Grummer, 1991; Garnsworthy et al., 2006) e che la loro produzione aumenti significativamente nel latte in maniera proporzionale alla presenza di butirrato nel grosso intestino. 

L’aumento dei NEFA circolanti in risposta all’HFCG potrebbe essere mediato da aumento della lipolisi, diminuzione della ri-esterificazione degli acidi grassi nel tessuto adiposo, diminuzione dell’ossidazione epatica o diminuzione della captazione e utilizzazione dei NEFA da parte dei tessuti periferici (Bell, 1995; Drackley, 2001; Roche et al., 2009).

Tuttavia, il mantenimento del peso vivo degli animali trattati con HFCG, ci dice come presumibilmente le riserve lipidiche non vengono di fatto mobilizzate.

Dato l’incremento registrato sugli acidi grassi preformati nel latte (in particolare i C18) possiamo pensare che il quantitativo totale di NEFA utilizzati sia ridotto, considerazione che viene parzialmente supportata anche dal concomitante decremento di BHB ematico registrato in animali supplementati con HFGC.

L’aumento di produzione di AGV nel grosso intestino fornisce un plausibile meccanismo sia per i miglioramenti nella salute intestinale che per la modulazione del metabolismo di tutto l’organismo (den Besten et al., 2013; Rios-Covian et al., 2016; Liu et al., 2018).

Il tratto gastrointestinale è uno degli apparati che richiedono un’importante domanda energetica rispetto agli altri tessuti del corpo (McBride e Kelly, 1990). Un’interruzione della funzione di barriera intestinale può aumentare ulteriormente tale richiesta a causa della immunoattivazione associata a tale fenomeno (Fox et al., 2005). Il miglioramento della salute intestinale può alterare positivamente la bioenergetica dell’intero animale

riducendo così il fabbisogno energetico del tratto gastrointestinale favorendo di conseguenza un risparmio di glucosio che può così essere dirottato verso la produzione di latte. Le differenze nei parametri ematici e il profilo degli acidi grassi del latte forniscono un ulteriore supporto all’ipotesi che la ripartizione energetica dei nutrienti sia la modalità d’azione più plausibile per le risposte osservate. Ulteriori approfondimenti sono necessari per caratterizzare con precisione le fermentazioni batteriche che avvengono a livello del grosso intestino in particolare per quanto riguarda la componente proteica, per meglio capire la risposta attesa di urea e di proteina nobile nel latte.

In generale le differenze tra le altre due tesi, pellet contro mangime in farina, sono apparse poco significative (McKnight et al.2019) 

Conclusioni

L’integrazione della dieta con calcio gluconato rumino-protetto (HFCG) nelle bovine da latte ha quindi aumentato la resa in grasso del latte e di conseguenza la produzione di latte ECM. Il cambiamento del profilo degli acidi grassi del latte suggerisce un aumento nell’incorporazione di acidi grassi di origine extra mammaria, un dato che viene supportato dalle osservazioni effettuate per parametri plasmatici chiave come Beta-idrossibutirrato (BHB) che diminuiscono e degli acidi grassi non esterificati (NEFA) che al contrario segnano un aumento.

Non sono state osservate grandi differenze tra i 2 diversi metodi di lavorazione del mangime (pellet vs farina) utilizzati per somministrare il calcio gluconato nella dieta.

Sono necessari ulteriori studi per caratterizzare meglio l’effetto di HFCG a livello del lume gastrointestinale e dell’epitelio, nonché affinare la comprensione delle risposte sia per quanto riguarda l’urea che per il profilo degli acidi grassi nel latte.

 

L’articolo originale, “Effects of supplemental calcium gluconate embedded in a hydrogenated fat matrix on lactation, digestive, and metabolic variables in dairy cattle“, è stato pubblicato a luglio 2021 sul J. Dairy Sci. 104:7845–7855 (doi.org/10.3168/jds.2020-20003).