Studio preliminare per classificare l’insilato di mais per alta o bassa contaminazione da micotossine utilizzando la spettroscopia nel vicino infrarosso.

L’insilato di mais è un alimento ampiamente diffuso nelle aziende zootecniche italiane. Questo alimento consente infatti di apportare un’adeguata quota di energia e di fibra nella razione delle bovine in lattazione, è altamente produttivo e si conserva con una certa facilità rispetto ad altri foraggi insilati. I microrganismi presenti sulla pianta insilata sono un fattore che influenza fortemente la buona riuscita del prodotto insieme alle buone pratiche di insilamento. Oltre alle perdite fisiologiche connesse all’attività dei ceppi batterici responsabili della corretta fermentazione degli zuccheri in acido lattico, un ruolo determinante viene svolto dalla microflora deteriorante, come enterobatteri, batteri sporigeni, lieviti e muffe, che possono liberare metaboliti che danneggiano la qualità del prodotto. Il microbiota della massa insilata cambia quindi durante il periodo di conservazione in trincea a causa di cambiamenti di temperatura, umidità, disponibilità di ossigeno e pH. Condizioni di conservazione inadeguate quindi possono portare a contaminazioni dell’insilato con produzione di micotossine e riduzione del valore nutrizionale. Va quindi sottolineato come la contaminazione con micotossine possa avvenire sia prima che dopo la raccolta del prodotto stesso.

Le micotossine in particolare sono composti tossici prodotti naturalmente da vari tipi di funghi che per la maggior parte appartengono ai generi Aspergillus, Fusarium, Alternaria e Penicillium (Bennet et al., 2003).

Bisogna inoltre considerare che l’insilato di mais può essere soggetto alla contaminazione di diverse micotossine contemporaneamente, causando perciò una co-contaminazione sia di micotossine regolamentate che emergenti (leggi anche “Micotossine emergenti negli insilati di mais: un’indagine condotta in Italia“) che portano a conseguenze negative sia dal punto di vista alimentare che riproduttivo, negli animali alimentati con questi prodotti non ottimali dal punto di vista sanitario (Zain, 2011). A tal riguardo, un recente studio condotto sull’insilato di mais ha evidenziato una co-contaminazione da micotossine, indicando che il 47% dei campioni conteneva cinque o più micotossine sulle 22 analizzate (Vandicke et al., 2019).

Inoltre, nonostante gli enti regolatori mondiali abbiamo posto dei limiti di legge massimi per cui certe concentrazioni di micotossine sono tollerate, molte micotossine dette “emergenti”, non sono sottoposte a normative che ne regolano la contaminazione. Certa è dunque la loro presenza negli insilati, ma dati di incidenza negli alimenti e gli effetti tossici legati alla loro ingestione sono scarsi e quindi meritano studi al fine di approfondire i loro effetti. A tal proposito, quindi, si rende necessaria una quantificazione sia delle micotossine regolamentate che delle emergenti per valutare la sanità degli alimenti impiegati in azienda. Gli approcci analitici più utilizzati per monitorare e quantificare le micotossine, fanno uso di metodi cromatografici e immunologici (Turner et al., 2009, Bueno et al., 2015) che forniscono in modo accurato le concentrazioni delle micotossine presenti nei campioni. Tuttavia, metodi alternativi e più veloci sono stati recentemente proposti e stanno ottenendo sempre più attenzione (Fumagalli et al., 2021). Tra questi, diversi studi fanno uso di tecnologie con spettroscopia ad infrarossi (NIR) sia per quantificare le concentrazioni di micotossine in diverse matrici anche ad uso zootecnico, che per classificare i campioni sulla base delle loro contaminazioni. Questo metodo si propone dunque come alternativa veloce, poco dispendiosa rispetto ai metodi analitici, per una valutazione rapida della contaminazione degli alimenti.  A causa degli effetti negativi delle micotossine sulla salute degli animali, un rapido monitoraggio della contaminazione dei mangimi risulta essere fondamentale per evitare perdite economiche e preservare la salute degli animali. L’uso di tecnologia NIR permette infatti di avere un veloce riscontro del problema e un numero maggiore e più frequente di analisi per garantire una maggiore sicurezza sanitaria e alimentare (Mallmann er al., 2020).

Il metodo proposto nel presente studio prevede l’impiego di spettroscopia NIR per classificare i campioni di insilato di mais sulla base della loro contaminazione da micotossine. La strategia adottata non prevedere di sviluppare calibrazioni quantitative dal momento che questa tecnica risulta essere poco sensibile alla bassa concentrazione nella quale questi composti possono essere presenti negli alimenti. A causa della difficoltà di sviluppare modelli di regressione robusti per la quantificazione di singole micotossine e in relazione al fatto che gli insilati sono di solito soggetti a co-contaminazione di queste, lo scopo del presente studio è stato quindi quello di ottenere dei modelli qualitativi in grado di discriminare gli insilati per le concentrazioni totali o le conte totali di gruppi di micotossine.

Nell’ambito di un’indagine sono stati raccolti 115 campioni di insilato di mais in aziende lattiero-casearie situate nella Pianura Padana e in Sardegna. Queste aziende sono state selezionate in modo casuale e visitate negli anni 2017-2019. I campioni sono stati analizzati con spettroscopia NIR utilizzando uno spettrometro Foss NIRSystem 5000 (Foss 5000 NIR systems; Foss Electric, York, UK) e caratterizzati per contaminazione da micotossine tramite un metodo di cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa (LC-MS/MS) per quantificare più di 500 composti secondari riportato da Sulyok et al. (2020). Per confrontare le performances delle classificazioni, sono stati adottati tre diversi livelli di cut-off per ciascuna contaminazione da micotossine al fine di assegnare a ciascun campione un livello di contaminazione alto o basso rispetto a questi valori. A tal fine, sono state create una classe di alta contaminazione e una classe di bassa contaminazione con campioni che avevano valori di infezione da micotossine superiori o inferiori ai limiti di cut-off identificati. Le calibrazioni sono state fatte per: (i) la concentrazione totale (μg/kg di sostanza secca o SS) e conta totale delle micotossine rilevabili (tossine di Aspergillus, tossine di Alternaria, zearalenone e suoi metaboliti, tricoteceni di tipo B, fumonisine e loro metaboliti, enniatine, fumonisine e loro metaboliti, enniatine, beauvericina, altre tossine emergenti di Fusarium, Penicillium e altre tossine fungine e tossine fungine non specificate); (ii) micotossine regolamentate (fumonisine B1 e B2, deossinivalenolo e zearalenone, quelli rilevati nei campioni) ed emergenti prodotte da Fusarium, denominate R&E- Fusarium tossine, conta e somma; (iii) solo le Fusarium tossine emergenti, denominate E-Fusarium tossine; (iv) fumonisine e loro metaboliti; (v) tossine di Penicillium, conta e somma, sulla base di un precedente lavoro proposto da Gallo et al. (2021). In particolare, per la somma totale di micotossine, i limiti di cut-off sono stati fissati arbitrariamente a 4000, 7000 o 10000 μg/kgdi sostanza secca, mentre per le conte sono stati fissati a 28, 31 o 34. Per le micotossine regolamentate e le micotossine emergenti prodotte da Fusarium i limiti scelti sono stati 1500, 2000 o 2500 (μμg/kg SS mentre per le conte erano fissati a 13, 14 o 15. Le micotossine emergenti prodotte da Fusarium sono state distinte in livelli di contaminazione alti o bassi con limiti di 700, 1000 o 1200 μg/kg SS, 1000, o 1200 μg/kg SS e 6, 7, o 8. Le classi della somma e conta delle fumonisine sono state identificate con livelli di 400, 700 o 1000 μg/kg SS e 4, 5 o 6 rispettivamente. Infine, le classi di micotossine prodotte da Penicillium sono state identificate con livelli di contaminazione superiore o inferiore a 150, 250 o 350 μg/kg di SS e 3, 4 o 5 come livelli per le conte. Per ogni limite di cut-off, i campioni che presentano valori di concentrazione di micotossine o conteggi inferiori alla soglia sono classificati come classe 1 o, se superiori alla soglia utilizzata, come classe 2. Gli spettri NIR sono stati analizzati con Principal component analysis (PCA) per individuare outliers, ovvero quei campioni con spettro il cui comportamento si discosta da quello degli altri oggetti del dataset. Questa analisi esplorativa non ha mostrato spettri con andamenti anomali e tutti i campioni sono quindi stati inseriti in calibrazione. I limiti specificati in precedenza per dividere i campioni tra alte e basse contaminazioni, hanno mostrato una distribuzione dei campioni sbilanciata nelle classi, con la maggior parte dei campioni nel gruppo a bassa contaminazione, mentre pochi campioni sono stati etichettati nella classe a alta contaminazione, caratterizzata quindi da un rischio più elevato di presenza di micotossine.

Per ovviare a questo sbilanciamento delle classi che avrebbe portato a calibrazioni errate, si è applicata una tecnica statistica denominata Synthetic minority Over-sampling Technique (SMOTE) che ha permesso di ri-bilanciare le classi. Il database così ri-bilanciato è quindi poi stato analizzato con tecnica statistica Random Forest per sviluppare le calibrazioni per i parametri sopra riportati. Tale procedimento è stato svolto per 100 volte al fine di non incorrere in buone calibrazioni dovute alla casualità della distribuzione dei campioni e le performances dei modelli sono state espresse come media e devianza standard delle ripetizioni.

I risultati ottenuti sono promettenti nel proporre questo metodo NIR per classificare i campioni di insilato di mais sulla base della loro contaminazione da micotossine e sono esposti in seguito. Il miglior modello predittivo per la somma e la conta totale della contaminazione totale da micotossine è stato ottenuto con cut-off di 10000 μg/kg SS e ha dato livelli di accuratezza espressa come media ± deviazione standard pari a 96,0 ± 2,7% mentre per la conta il cut-off ottimale è stato 34 ed ha dato accuratezza di 97,1 ± 1,8%. Le micotossine regolamentate ed emergenti prodotte da Fusarium hanno ottenuto un’accuratezza leggermente inferiore al 90%. Nel caso della calibrazione per le micotossine emergenti prodotte da Fusarium l’accuratezza del modello per la concentrazione con cut-off di 1200 μg/kg SS si è attestata a 90,6 ± 3,1% e a 97,0 ± 1,7% per la conta e cut-off di 8. Per la categoria di contaminazione da micotossine Penicillium, è stata ottenuta un’accuratezza del 95,1 ± 2,8% utilizzando un limite di cut-off di 350 μg/kg di SS come somma totale o del 98,6 ± 1,3% per il limite di cut-off di 5 come numero di micotossine che contaminavano i campioni.

In definitiva la spettroscopia NIR presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi analitici tradizionali, principalmente grazie alla sua capacità di essere uno strumento rapido, non distruttivo ed economico in grado di stimare simultaneamente diversi parametri chimico-biologici dei campioni. Tale tecnologia ha ricevuto sempre più attenzione per stimare la concentrazione delle micotossine nei prodotti ad uso zootecnico, tuttavia i livelli di concentrazione molto bassi delle micotossine potrebbero limitare l’efficacia dell’individuazione e della quantificazione della contaminazione del mais.

Il metodo NIR sviluppato ed esposto, cerca di ovviare a questa possibile limitazione, basandosi sul rilevamento delle somme o dei conteggi di diverse micotossine, senza concentrarsi su una specifica tossina fungina permettendo anche di valutare la contaminazione dovuta alla co-presenza di diverse micotossine. Grazie poi al procedimento di ri-equilibrazione delle classi di contaminazione, il metodo ha prodotto buoni modelli di calibrazione in termini di accuratezza, sensibilità e specificità proponendosi come metodo di screening adeguato a fornire informazioni rapide sulla contaminazione da micotossine degli insilati.

La presente nota è una sintesi del seguente articolo scientifico accettato per la pubblicazione su Toxins (MDPI), dove è riportata tutta la letteratura citata: Ghilardelli, F., Barbato M., and A. Gallo (2021). A Preliminary Study to Classify Corn Silage for High or Low Mycotoxin Contamination by Using near Infrared Spectroscopy. Toxins 2022, 14, 323.

Autori

Giuseppe Conte, Alberto Stanislao Atzori, Fabio Correddu, Antonio Gallo, Antonio Natalello, Sara Pegolo, Manuel Scerra – Gruppo Editoriale ASPA