Effetti del microbiota del pastone di farina umida insilata e del rumine per ridurre le aflatossine nella filiera lattiero-casearia: risultati del progetto AFLA1MILK.

Le aflatossine sono un gruppo di composti tossici e cancerogeni prodotti da diverse specie di Aspergillus, le quali possono contaminare gli alimenti zootecnici. La loro produzione è legata a ceppi di Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus i quali sono in grado di contaminare la pianta in campo in caso di condizioni metereologiche particolari che favoriscono l’attacco da parte di questo fungo. Quando si presentano condizioni di stress dovute alla siccità o alle alte temperature, può accadere che il fungo produca aflatossine durante la crescita della pianta. Le aflatossine finora conosciute sono 6: B1, B2, G1, G2, M1 e M2. Tra queste la AFB1 è quella maggiormente presente, più tossica, cancerogena e mutagena.

I ruminanti sono considerati meno suscettibili dei monogastrici agli effetti negativi dovuti all’ingestione delle micotossine. Questo perché il comparto rumine-reticolare è capace di modificare la struttura delle micotossine convertendola in metaboliti meno tossici per l’animale (Fink-Gremmels, 2008) o di legare le micotossine a dei composti rendendole non disponibili per l’animale (Yiannikouris e Jouany, 2002; Diaz e Smith, 2005).

Nel caso delle aflatossine, il meccanismo di protezione messo in atto dagli animali è il sequestro della tossina, in quanto le molecole madri come AFB1 sono trasformate in metaboliti con grado di tossicità e cancerogenicità spesso uguali a quello della molecola madre (eg: aflatossicolo). Se ingerita dagli animali in lattazione la micotossina passa nel latte come suo metabolita, l’aflatossina M1 (Battacone et al., 2009; Masoero et al., 2007). Per questi motivi, la contaminazione da AFB1 causa problemi sia a livello delle bovine da latte, ma soprattutto a livello del latte come metabolita AFM1, a causa del carry-over nel latte con tasso di escrezione che può variare dallo 0.1% a più del 6% (Battaccone et al., 2003).

L’allevatore deve fare particolarmente attenzione a questo tipo di micotossine, perché nelle annate in cui le condizioni meteorologiche sono tali da favorire un forte sviluppo delle aflatossine in campo (esempio, le annate 2003, 2007, 2011 e 2015), le normali pratiche di prevenzione agronomica e di conservazione non riescono ad annullare del tutto il problema legato alla contaminazione degli alimenti. La gestione quindi del rischio di contaminazione da questo genere di micotossine rimane una problematica chiave per tutta la filiera produttiva.  La problematica della contaminazione di aflatossine negli alimenti in definitiva è legata sia alle materie prime che vengono acquistate sul mercato, anche se le filiere negli anni hanno adottato buone pratiche che hanno drasticamente ridotto il pericolo di contaminazione del latte, ma talvolta anche ai prodotti che vengono conservati in trincea, come insilato di mais o pastone di farina umida o pastone integrale classificati come a rischio medio di contaminazione, soprattutto in annate particolari.

Il progetto Afla1milk, finanziato dal Mistero delle politiche agricole nell’ambito del fondo per gli investimenti nel settore lattiero-caseario e coordinato dall’Università di Udine in collaborazione con l’Università Cattolica del Sacro Cuore, ha avuto come obiettivo la valutazione dell’ambiente microbico presente negli insilati e quello presente a livello ruminale in termini di capacità di attenuare il contenuto di sostanze tossiche prodotte dallo sviluppo dei funghi, aflatossine in particolare, e quindi di ridurre la concentrazione iniziale della AFB1.

Un problema comune nelle aziende zootecniche è la presenza nel pastone (farina umida) insilato di parti aerobicamente instabili durante la fase di fermentazione. Durante questa fase, tale prodotto può presentare delle zone calde che favoriscono la proliferazione di muffe e lieviti, aumentando dunque il rischio contaminazione da micotossine (Gallo et al., 2016). Sulla base di quanto riportato da Winn e Lane (1978), una produzione sufficiente di aflatossina in pastone a una temperatura di 25 °C dopo un breve tempo di incubazione (72 h) può risultare dannosa per il bestiame. Quindi, la formazione di questa micotossina a livello aziendale può essere un problema a cui far fronte nelle regioni temperate calde (Ferrero et al., 2019).

Sulla base di queste problematiche ed esigenze, in fase di insilamento si è voluto verificare come l’impiego di inoculi lattici come Lentilactobacillus buchneri, Levilactobacillus brevis, o Lactiplantibacillus plantarum, possano migliorare la qualità delle fermentazioni che avvengono nella massa insilata, interferire con la microflora che si sviluppa durante l’insilamento e attuare meccanismi di detossificazione/biotrasformazione, reale o apparente, dell’AFB1, nonché aumentare la stabilità aerobica del pastone stesso come riportato da autori quali Adesogan e Arriola (2020) e Muck et al. (2018). Tuttavia, gli effetti anti-fungini di questi prodotti possono ritenersi in parte incerti, soprattutto per una matrice come il pastone di farina umida in cui possono verificarsi microambienti ricchi in ossigeno con muffe verdi-gialle chiaramente visibili indicativi di presenza di aflatossine (Cheli et al., 2013; Gallo et al., 2015, 2021).

È tuttavia da riportare che gli effetti antimicotici di batteri lattici (LAB) sono legati alla loro produzione di metaboliti come acidi organici (ad esempio acido propionico, acido acetico), batteriocine o composti fenolici (acido fenil lattico, acido n-decanoico e 3-idrossidodecanoico) (Sadiq et al., 2019). Inoltre, altri modi di azione che i LAB possono attuare per ridurre la contaminazione da micotossine è causare la depolarizzazione della membrana dei microorganismi ostacolando così la crescita dei funghi (Mieszkin et al., 2017).  Tuttavia, i LAB possono anche adsorbire le micotossine nelle loro pareti cellulari (Lahtinen et al., 2004; Gallo e Masoero, 2009); tale meccanismo risulta però essere influenzato dalla struttura molecolare, concentrazione, numero e stato fisiologico delle cellule (Peltonen et al., 2000; Gratz et al., 2005; Wang et al., 2015; Ma et al., 2017; Sadiq et al., 2019).

Ad ogni modo, l’uso di inoculanti contenenti batteri eterofermentativi obbligati, come Lentilactobacillus buchneri, può aumentare la stabilità aerobica del pastone insilato (Kristensen et al., 2010; Muck et al., 2018).

L’obiettivo del presente studio è stato quello di confrontare i parametri di fermentazione e il contenuto di micotossine in pastone ottenuto con piante inoculate in campo con un ceppo tossigeno di A. flavus, trattati al momento dell’insilamento con inoculanti commerciali contenenti L. buchneri oppure trattati con inoculi puri.

Un ibrido di mais classe FAO 700 (Pioneer Hi-Bred International, Inc., Des Moines, IA, USA) coltivato nel 2019 presso il Centro Ricerche Zootecniche (CERZOO S.r.L., San Bonico, Italia) è stato inoculato con un ceppo tossigeno di A. flavus (ITEM 8069, 1×105 spore/mL) (Giorni et al., 2019). Oltre alla tesi di controllo senza inoculo, i trattamenti con LAB che sono stati testati sono i seguenti: (i) prodotto commerciale contenente Lentilactobacillus buchneri LB1819 e Lactococcus lactis O224 (SiloSolveR FC, Chr. Hansen A/S, Horsholm, Denmark; SiloSolve FC1x); (ii) cinque volte la dose del prodotto commerciale contenente Lentilactobacillus buchneri LB1819 e Lactococcus lactis O224 (SiloSolveR FC, Chr. Hansen A/S, Horsholm, Denmark; SiloSolve FC5x); (iii) prodotto commerciale contenente Lentilactobacillus buchneri e Lactiplantibacilluss plantarum (PioneerR brand 11B91 HMC Inoculant, Pioneer Hi-Bred International, Des Moines, IA, USA; Pioneer 11B91); e ceppi puri di (iv) Levilactobacillus brevis DSMZ 20054 (Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen, LB DSMZ 20054); (v) Lactiplantibacillus plantarum ATCC 8014 (American Type Culture Collection) (LP ATCC 8014); (vi) Lactiplantibacillus plantarum PB (LP PB); (vii) Lacticaseibacillus rhamnosus ATCC 7469 (LR ATCC 7469); (viii) Lacticaseibacillus rhamnosus LR7 (LR LR7); or (ix) Lacticaseibacillus rhamnosus RI (LR RI).

La dose finale applicata era di 250.000 CFU/g per ogni trattamento, con l’eccezione del secondo trattamento 2, che aveva una dose di 1.250.000 CFU/g. In particolare, la concentrazione di cellule microbiche degli inoculanti commerciali è stata calcolata in base all’etichetta del prodotto, mentre per i singoli inoculanti le concentrazioni sono state quantificate in laboratorio tramite conta in piastra in agar MRS (Gallo et al., 2021).

Per ogni trattamento sono stati creati mini-silos (secchi di plastica da 20 L, riempiti con circa 11,1 ± 0,31 kg di mais tal quale, compattato a una densità di 389 ±4,6 kg DM/m3, e poi sigillati con coperchi di plastica e conservati a 20,4 °C ±0,52) che successivamente sono stati aperti dopo 30 o 120 giorni. Lo studio degli effetti dei nove inoculanti LAB, tre prodotti commerciali e sei ceppi LAB puri, ha indicato che nessuno di essi ha abbassato i livelli di aflatossine nel pastone di farina umida in modo significativo, perciò risultando inefficienti per questo specifico scopo. Tuttavia, le quantificazioni di altre micotossine hanno indicato che zearalenone e acido tenuazonico non sono stati rilevati al giorno 30 o al giorno 120, anche se erano state quantificate nel prodotto alla raccolta e prima dell’insilamento. Le caratteristiche di fermentazione del pastone insilato differivano tra i gruppi di LAB. In particolare, gli inoculanti commerciali testati ed il ceppo puro LR LR7 hanno aumentato i livelli di acido acetico e 1,2 propandiolo e migliorato la stabilità aerobica dell’insilato HMC rispetto al pastone non trattato. Pertanto, lo studio ha mostrato che i tre inoculi LAB commerciali e LR LR7 hanno migliorato il profilo di fermentazione e ridotto la contaminazione da micotossine (ZEA e acido tenauzonico), ma non hanno influenzato i livelli di aflatossina nel pastone di mais. Ulteriori studi sono stati pianificati dal gruppo di ricerca per capire l’interazione fra microbiota degli insilati e presenza di micotossine.

La presente nota è una sintesi del seguente articolo scientifico pubblicato su Animal Feed Science and Technology dove è riportata tutta la letteratura citata: Gallo, A., F. Fancello, F. Ghilardelli, S. Zara, and M. Spanghero. 2022. Effects of several commercial or pure lactic acid bacteria inoculants on fermentation and mycotoxin levels in high-moisture corn silage. Animal Feed Science and Technology 286 (2022): 115256.

 

Autori

Giuseppe Conte, Alberto Stanislao Atzori, Antonio Gallo, Sara Pegolo, Fabio Correddu, Manuel Scerra e Antonio Natalello – Gruppo editoriale ASPA