In questo nuovo articolo della Rubrica “Oxilem” affrontiamo come argomento lo stress ossidativo. Oxilem è un prodotto caratterizzato dall’avere un’attività antiossidante, che si riflette sui processi infiammatori, sull’efficienza del sistema immunitario, sull’assorbimento dei nutrienti e sul benessere intestinale degli animali.

Una delle caratteristiche che rende Oxilem un prodotto utile e versatile in campo zootecnico è sicuramente la sua attività antiossidante, che si riflette sui processi infiammatori, sull’efficienza del sistema immunitario, sull’assorbimento dei nutrienti e sul benessere intestinale delle più importanti specie allevate. L’importanza di conoscere, e quindi prevenire, lo stress ossidativo è fondamentale proprio per gli effetti che ha sulla salute dell’animale e sulla produzione.

In vivo infatti, stati di stress ossidativo determinano una ridotta produzione di latte, mastiti, abbassamento della fertilità, rallentamento nella crescita, compromettendo in generale lo stato di salute dell’animale. Alla base dello stress ossidativo vi sono i radicali liberi, specie chimiche dotate di elevata reattività ed instabilità dovute alla presenza di un elettrone spaiato. I radicali hanno la capacità di reagire con svariate molecole con cui vengono in contatto dalle quali sottraggono o alle quali cedono un elettrone nel tentativo di acquisire stabilità, producendo in tal modo altri radicali secondo reazioni che si propagano spesso a catena. Tali composti possono essere generati dall’ossigeno, componente chiave degli organismi aerobi (tra cui per esempio uomini e animali), poichè fondamentale per la produzione di energia necessaria per sostenere l’attività di tessuti e organi. Le specie reattive dell’ossigeno, chiamate ROS comprendono per esempio l’anione superossido (O2−), il perossido di idrogeno (H2O2) ed il radicale ossidrilico (OH•), composti altamente dannosi per le cellule in grado di ossidare le macromolecole biologiche e di determinare gravi alterazioni alle membrane cellulari, ad enzimi e recettori, con conseguenti danni alle cellule e al genoma (Giovannini, et al., 2006). Per contrastare l’attività dei radicali liberi, gli organismi aerobi possiedono un sistema di difesa antiossidante; quando si verifica però uno squilibrio fra sostanze ossidanti ed antiossidanti si instaura una condizione di stress ossidativo, che si riflette negativamente sullo status immunitario dei soggetti predisponendoli all’insorgenza di diverse patologie.

Negli animali di interesse zootecnico, lo stress ossidativo si verifica principalmente in corrispondenza di particolari fasi fisiologiche: nelle bovine da latte, per esempio, sono fasi critiche il periodo del periparto e la fase iniziale della lattazione, in corrispondenza delle quali si verificano importanti cambiamenti fisiologici caratterizzati da intensa attività metabolica. L’aumento dell’attività metabolica è associato ad un aumento del metabolismo energetico e ad un aumento del consumo di ossigeno, con conseguente aumento della produzione di ROS.

La formazione di radicali e l’ossidazione delle componenti biologiche è limitata dall’azione di sistemi antiossidanti endogeni (prodotti dall’organismo di cui sono parte integrante) od esogeni (devono essere introdotti dall’esterno, per esempio con una corretta alimentazione); questi ultimi comprendono sostanze chimiche naturali (vitamine, composti di natura fenolica, tocoferoli, minerali) e sintetiche (butilato-idrossianisolo (BHA), butilato-idrossitoluene (BHT) e propil gallato (PG)) (Ge, Wei, & Li, 2014). I costi di produzione, il rischio potenziale per la salute umana e degli animali hanno dato luogo ad una crescente domanda di antiossidanti naturali e sicuri segnando un crescente interesse proprio per i polifenoli anche in campo zootecnico. Risulta inoltre fondamentale, nell’ottica di una alimentazione zootecnica sostenibile e di una economia circolare, poter utilizzare sostanze naturali, fonti rinnovabili o sottoprodotti come materie prime, per ottenere antiossidanti naturali.

In questo contesto si inserisce l’uso di Oxilem in qualità di potente antiossidante naturale. La lignina, da cui si ricava Oxilem, è una sostanza non tossica, biodegradabile e biocompatibile la cui azione antiossidante è dovuta alla presenza di gruppi ossidrilici di tipo fenolico (Ge, Wei, & Li, 2014), in grado di donare l’atomo di idrogeno ai radicali liberi interrompendo così la propagazione delle reazioni a catena tipiche dei processi ossidativi. Inoltre, la presenza di gruppi metossilici (-OCH3) nella struttura della lignina, dà stabilità all’intermedio radicale libero che si forma, secondo la reazione schematizzata in Figura 1 (Liangliang, Guanhua,Hongyu, Wenjie, & Chuanling, 2017).

Figura 1. Reazione generica della lignina con un radicale e rappresentazione della delocalizzazione dell’elettrone dell’ossigeno sull’anello aromatico.

Il trattamento di idrolisi, alla base della produzione di Oxilem, converte la lignina da grosso polimero reticolato ad una miscela di sostanze polifenoliche con peso molecolare più basso e attività biologica più elevata (Maggiolino, et al., 2019). Tale depolimerizzazione, porta infatti alla scissione di legami eterei della sua struttura reticolata e alla conseguente formazione di nuovi gruppi -OH liberi, disponibili a cedere un idrogeno ai radicali e a stabilizzare la catena radicalica (Ge, Wei, & Li, 2014). Con la diminuzione del peso molecolare, il contenuto totale di gruppi fenolici e metossilici liberi aumenta, migliorano pertanto le sue proprietà antiossidanti del prodotto (Liangliang, Guanhua, Hongyu, Wenjie, & Chuanling, 2017). È noto che l’azione antiossidante dei polifenoli comprende meccanismi diretti di scavenging dei ROS ed in generale dei radicali, la modulazione favorevole dell’attività di enzimi coinvolti nella rimozione dei ROS (SOD, catalasi ecc) e di enzimi endogeni antiossidanti (Glutatione) (ROS removing level) e può coinvolgere anche metalli come ferro e rame, catalizzatori nel processo di ossidazione dei lipidi, ed enzimi produttori di ROS (Sandoval-Acuna, Ferreira, & Speisky, 2014). I polifenoli sono anche in grado di ripristinare i tocoferoli (famiglia di composti che comprende la Vitamina E), anch’essi antiossidanti. Questa capacità è dovuta al loro potenziale redox; gli antiossidanti con il potenziale redox più basso (più riducenti) sono in grado di rigenerare (ridurre) altri antiossidanti a loro volta ossidati in reazioni radicaliche.

Per questi motivi, si è dimostrata una buona strategia l’uso associato della vitamina E e dei polifenoli, determinando così un significativo risparmio di tocoferolo e garantendo, allo stesso tempo, una maggiore efficienza e un rapido recupero della forma attiva dei tocoferoli, soprattutto nelle fasi critiche dell’animale (fasi iniziali in polli da carne, galline ovaiole e tacchini; svezzamento e post-svezzamento nei suini, periparto in scrofe e bovini) (iGreen, 2017).

Studi in Vitro effettuati

  • Caratterizzazione dell’attività antiossidante totale di Oxilem tramite test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) e attività antiossidante esercitata dalle specie idrofiliche (H-ORAC) e lipofile (L-ORAC) presso l’istituto kurz italia s.r.l.
  • Valutazione della capacità di Oxilem nel ridurre in vitro la produzione cellulare di ROS in risposta all’esposizione ai raggi UVA; valutazione della modulazione dell’attività dell’enzima Superossido Dismutasi (SOD) a seguito del trattamento con Oxilem e determinazione dell’espressione di Elastasi ed Ialuronidasi a seguito del trattamento con Oxilem, presso LABORATORIO Abich.

Le proprietà antiossidanti di Oxilem sono state valutate in vitro presso laboratori indipendenti, enti di ricerca e Università, e i risultati sono di seguito sintetizzati. Presso l’istituto Kurz Italia s.r.l., laboratorio specializzato in analisi degli alimenti, cosmetici, farmaci, prodotti biochimici e mangimi è stata quantificata la capacità antiossidante di Oxilem mediante metodica ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) (Responsabile scientifico Dott. C. Bender). Tale test ORAC si basa sulla capacità di Oxilem di catturare radicali liberi (radicali perossilici, ROO●), misurata attraverso il decadimento dell’intensità di fluorescenza di una molecola target. È stata valutata l’attività antiossidante esercitata dalle specie idrofiliche (H-ORAC) e lipofile (L-ORAC) presenti in Oxilem. I risultati sono espressi come μmoli Trolox equivalenti, composto antiossidante utilizzato come standard di riferimento.

È emerso che la capacità antiossidante totale di Oxilem è pari a 362.959 μmoli Trolox/100g dato dalla somma della capacità antiossidante relativa alle specie idrofiliche (277.274 μmoli Trolox/100g) e delle specie lipofiliche (85.658 μmoli Trolox/100g). Sostanze note per la loro attività antiossidante come la prugna rossa o il mirtillo mostrano valori di ORAC pari rispettivamente a 6.239 μmoli Trolox/100g e 4.848 μmoli Trolox/100g (Istituto Kurz Italia Srl , 2019).

L’effetto antiossidante di Oxilem è stato valutato anche presso il laboratorio di analisi biologiche e chimiche Abich (Responsabile scientifico Dott.ssa E. Bocchietto), insieme alla sua capacità di ridurre in vitro la produzione cellulare di ROS in risposta all’esposizione ai raggi UVA, fattore ambientale che determina infatti un aumento della produzione di ROS. Per il trial, sono stati utilizzati cheratinociti umani esposti per tempi diversi a raggi UVA. La formazione dei ROS post esposizione agli UVA viene rilevata utilizzando una sonda fluorogenica (2-7 Dichlorodihydrofluorescein diacetato, DCFH-DA) in grado di misurare lo stato redox di una cellula: la sonda in presenza di radicali liberi dell’ossigeno (ROS) viene rapidamente ossidata convertendosi in una molecola altamente fluorescente. L’intensità della fluorescenza emessa pertanto, è direttamente proporzionale alla concentrazione di ROS presenti. La lettura in fluorimetria permette di avere un dato quantitativo correlato alla presenza di ROS nelle cellule analizzate.

È stata evidenziata una riduzione della formazione dei ROS nelle cellule trattate con Oxilem in modo dose-risposta; tale riduzione è indice di un effetto antiossidante. In particolare, la percentuale di inibizione della formazione di ROS dopo solo 20’ di esposizione agli UVA è pari all’84,4% per Oxilem alla concentrazione di 150 μg/ml contro il 45,2% per la Vitamina C alla stessa concentrazione (utilizzata come controllo positivo), pertanto si può concludere che Oxilem inibisce il rilascio di ROS indotti da UVA in cheratinociti umani. (Abich, analisi biologiche e chimiche, 2015).

Presso lo stesso laboratorio, è stata valutata poi la potenzialità antiossidante di Oxilem misurando l’attività dell’enzima Superossido Dismutasi (SOD), uno dei più importanti enzimi antiossidanti endogeni che catalizza, nelle cellule, la dismutazione dell’anione superossido (O2-) in perossido di idrogeno (H2O2) e ossigeno molecolare (O2). In particolare, tramite analisi colorimetrica viene valutata l’inibizione della formazione del formazano, substrato cromogenico, rilevabile a 450 nm, la cui formazione è inibita in presenza di un eventuale agente antiossidante.

Dalle analisi effettuate emerge che Oxilem è in grado di aumentare l’attività della SOD in modo dose-risposta; in particolare, l’effetto maggiore si riscontra alla concentrazione di 0,25%, in quanto l’inibizione della formazione del composto colorato è del 75% indice di un effettivo aumento dell’attività della SOD. Si può pertanto concludere che Oxilem è in grado di aumentare l’attività della SOD, mostrando attività antiossidante (Abich, analisi biologiche e chimiche, 2016). Tale aspetto è fondamentale, in quanto, un difetto o una riduzione dell’attività dell’enzima SOD, si traduce in elevati livelli dell’anione superossido, responsabile di danni cellulari e mutagenesi (Nićiforović & Abramovič, 2014).

È nota inoltre la capacità dei ROS di accelerare l’invecchiamento cutaneo inducendo una stimolazione dell’espressione di proteasi come la ialuronidasi e l’elastasi responsabili del rimodellamento della matrice extracellulare. L’elastasi in particolare è un enzima prodotto soprattutto dal pancreas la cui funzione è quella di spezzare e degradare la struttura dell’elastina, fibra elastica che, insieme al collagene, determina le caratteristiche del tessuto connettivo delle cellule.

È stata quantificata la capacità di Oxilem di inibire in vitro l’enzima ialuronidasi risultata pari al 30% (Abich, analisi biologiche e chimiche, 2017) mentre si evidenzia una inibizione della elastasi del 36.07% dopo solo un minuto (Abich, analisi biologiche e chimiche, 2017) (Responsabile scientifico per entrambi i lavori Dott.ssa E. Bocchietto).

Alla luce dei risultati delle sperimentazioni condotte, può essere concluso che Oxilem mostra in vitro un importante effetto antiossidante.

Studi in Vivo effettuati

  • Valutazione dell’effetto antiossidante di Oxilem tramite test fotometrico d-ROMs, quantificazione del potenziale biologico antiossidante tramite test BAP e rilevamento dei fattori ematici di immunità su vacche da latte.
  • Valutazione dell’effetto antiossidante di Oxilem tramite test fotometrico d-ROMs su scrofe.

Per quanto gli studi in vitro siano indicativi di una elevata potenzialità di Oxilem come prodotto antiossidante adatto alla zootecnia, sono gli studi in vivo finora effettuati a sottolineare come questo prodotto possa davvero rappresentare un integratore innovativo per il benessere animale, con conseguente aumento della qualità delle produzioni. Qui di seguito vengono riportati studi condotti su vacche da latte e su scrofe in condizioni di elevato stress ossidativo. Per quanto riguarda le vacche da latte, Oxilem è stato testato in fase di periparto. Uno studio condotto dalla Michigan State University (USA) sulle bovine in transizione, ha evidenziato come il progressivo sviluppo dello stress ossidativo può essere considerato la base di un’alterata risposta infiammatoria, che interessa la ghiandola mammaria, determinando frequenti casi di mastiti. Durante il periparto, in particolare, all’inizio della lattazione, la bovina aumenta il fabbisogno energetico e di ossigeno. L’elevata richiesta di ossigeno comporta una maggiore produzione di ROS, mentre il fabbisogno energetico è accompagnato dal rilascio di acidi grassi nel flusso sanguigno, grassi che, in quanto liberi, sono estremamente suscettibili al danno ossidativo. Durante questo delicato periodo si crea inoltre uno sbilanciamento fra specie ossidanti e antiossidanti che porta ad uno stato di stress ossidativo. Tale stress determina una incontrollata risposta infiammatoria che, come già detto, aumenta il rischio di mastiti. Negli USA, ogni anno le mastiti determinano una perdita agli allevatori di due miliardi di dollari per la riduzione della produzione di latte come conseguenza della malattia.

Secondo Lorraine Sordillo, specialista nella prevenzione e nel controllo della mastite, una possibile soluzione per ridurre la gravità e la durata di tale patologia è utilizzare un regime alimentare che contenga adeguate dosi di antiossidanti (Macchiorlatti-Vignat, 2014). In vivo è stato valutato l’effetto antiossidante di Oxilem utilizzando parametri indicatori dello stato ossidativo come test fotometrico d-ROMs (Reactive Oxygen Metabolites) ed il test BAP (Biological Antioxidant Potential). In particolare, per la prova sono stati coinvolti gruppi significativi di vacche da latte la cui razione alimentate è stata integrata con Oxilem a partire da 20 giorni antecedenti il parto.

Il d-ROMs quantifica la capacità ossidante totale del sangue in termini di U. Carr (Unità Caratelli) dovuta alla presenza di ROS. In assenza di stress ossidativo, il d-ROMs assume un valore compreso fra 250 e 300 Unità Carr (una U Carr equivale a 0.08 mg/dL di una soluzione di perossido di idrogeno); valori superiori a 300 U Carr sono indicativi invece, di una condizione di stress ossidativo (Iorio).

Nel trial in questione i valori in U Carr delle bovine da latte la cui razione alimentare è stata integrata con Oxilem, sono inferiori rispetto al controllo, per tutta la durata del test (Figura 2) (Rossi, 2015).

Figura 2. Cinetica del d-ROMs test in bovine in fase di pre e post parto.

Il BAP test (Figura 3) invece, è utilizzato per quantificare il potenziale biologico antiossidante nel siero o plasma (Iorio), determinato misurando la concentrazione ematica di sostanze antiossidanti in grado di ridurre il ferro dalla forma ferrica a quella ferrosa, utilizzato come indicatore redox. I risultati del BAP test vengono espressi in μmoli di ferro ridotto per litro di campione esaminato e tale valore è correlato ad un eventuale grado di compromissione della barriera antiossidante; ciò vuol dire che valori più alti in termini di μmoli di ferro ridotto/L, corrispondono ad una minima compromissione degli antiossidanti e quindi ad un migliore potenziale biologico endogeno antiossidante e quindi corrispondono ad una situazione più favorevole. (Vacche da latte: la fase del periparto, 2015). In maniera analoga per quanto visto per le bovine da latte è stato condotto il d-ROMS test su 90 scrofe nella fase di pre e post parto; anche in questo caso l’integrazione con Oxilem riduce notevolmente la capacità ossidante totale del sangue (Figura 4), a dimostrazione dell’effetto antiossidante del prodotto.

Figura 3. Andamento dei valori del BAP test in bovine.

Figura 4. Cinetica del d-ROMs test in scrofe in fase di pre e post parto.

Pertanto, dall’analisi dei parametri di stress ossidativo emerge che il trattamento con Oxilem è in grado di ridurre la presenza di composti ossidanti nel plasma ed allo stesso tempo è in grado di migliorare il potere antiossidante plasmatico, cioè la capacità dell’organismo di contrastare la formazione dei radicali liberi dell’ossigeno (Nascimbeni, 2017).