Introduzione

Il grasso di latte (MF) è uno dei prodotti alimentari più costosi; pertanto, può essere oggetto di frodi (sostituzione con grassi o oli più economici). In alcuni paesi (in particolare nei paesi in via di sviluppo), l’adulterazione dei prodotti lattiero-caseari è riconosciuta come un problema serio. Ad esempio, in Romania, le istituzioni statali sono a conoscenza della pratica della contraffazione di prodotti lattiero-caseari su larga scala. Pertanto, il 21 gennaio 2020 è stato istituito un accordo tra l’Autorità nazionale per la protezione dei consumatori e l’Associazione dei produttori dell’industria lattiero-casearia rumena, finalizzato alla collaborazione delle due parti per ridurre la pratica di contrastare la contraffazione dei prodotti lattiero-caseari (ANPC, 2020). L’accordo dimostra che la frode nel settore lattiero-caseario è un problema riconosciuto dalle autorità; di conseguenza, è necessario sviluppare metodi efficienti per l’individuazione di prodotti contraffatti/adulterati. Il grasso di latte si distingue da altri grassi e oli per il contenuto di acidi grassi a catena corta e media (FA). Il metodo standard per la determinazione accurata del profilo degli acidi grassi (FAP) del latte e dei prodotti lattiero-caseari, GC, richiede sostanze chimiche nocive e richiede tempo (quasi 2 h/campione con un operatore esperto). Di conseguenza, i metodi alternativi più veloci sono benvenuti. Recentemente, i metodi spettroscopici accoppiati con l’analisi di dati multi variata hanno ricevuto l’attenzione, poichè sono considerevolmente più veloci e più convenienti dal punto di vista della procedura pratica.

Ad esempio, regressione parziale modificata del minimo quadrato applicata su dati spettroscopici vicino all’infrarosso ha permesso la quantificazione di 19 FA nel formaggio (da C8:0 a C20:0, comprese le specie sature e insature) con livelli di confidenza individuali fino al 96%. Le capacità, i vantaggi, le limitazioni e gli svantaggi di altri cromatografici (GC-MS, HPLC, LC-MS) e spettrale [fluorescenza, infrarosso di trasformata di Fourier, vicino infrarosso, infrarosso medio, risonanza magnetica nucleare (NMR)] Le tecniche combinate con l’analisi multivariata dei dati per rilevare l’adulterazione dei prodotti lattiero-caseari sono state sistematicamente discusse in eccellenti revisioni.Il metodo standard per la determinazione specifica della frazione butirrica delle miscele grasse contenenti MF o MF si basa sulla saponificazione del grasso con KOH. La FA corrispondente viene liberata dai saponi risultanti mediante acidificazione con H3PO4, prima della separazione della FA insolubile in acqua e solubile in acqua. L’acido butirrico è successivamente determinato direttamente da GLC in presenza di acido valerico come standard interno . Anche se accurato, il metodo è laborioso, e reagente e richiede tempo. Sacchi et al.(2018) ha recentemente sviluppato un metodo più veloce per la determinazione dell’acido butirrico nelle miscele MF con lardo e margarina vegetale attraverso la spettroscopia 13C-NMR, basato sulle risonanze C1 e C2 distinte della struttura butirrica, utilizzate come marcatori dei triacilgliceroli del latte. Un approccio moderno basato sulla spettroscopia Raman accoppiata con la chemiometria ha permesso la quantificazione di 28 FA dal burro, compreso C4:0, come influenzato dai sistemi di alimentazione della mucca. Un recente documento che mira alla determinazione del FAP di MF attraverso equazioni chemiometriche sui dati 1H-NMR ha riportato una rapida quantificazione della FA su 4 classi: a catena corta, poloinsaturi, monoinsaturi e saturi a catena lunga. Le equazioni sono il risultato degli integrali dei segnali 1H-NMR di MF, basati sul contributo di protoni specifici da ogni classe FA. Per esempio, l’AF a catena corta è stato determinato dall’integrale della tripletta a 0,96 ppm (assegnato al metile terminale delle catene di C4-C8 acile) ponderato contro tutti i protoni terminali metilici di tutte le catene grasse acriliche. Il metodo è stato ulteriormente applicato per la differenziazione dei sostituti del formaggio (costituiti da ingredienti vegetali) dai formaggi genuini a base di latte bovino e per l’individuazione della teratificazione di formaggio con grassi “esogeni” (principalmente olio di palma) sulla base del rapporto di lungocatena:FA a catena corta, di norma inferiore a 6,89 per i bovini MF. L’adulterazione di prodotti lattiero-caseari con altri grassi e oli comporterà un aumento del rapporto di cui sopra, considerando che l’unica fonte di AF a catena corta è MF. Il principale svantaggio di questo approccio è che n-3 FA (come l’acido linolenico) ha anche una risonanza 1H-NMR (anche tripletta) a 0,96 ppm, che si sovrappone alla tripletta della FA a catena corta; pertanto, queste 2 specie non possono essere determinate in modo indipendente. Inoltre, solo C4:0 contribuisce alla tripletta di 0,96 ppm; il metile di C6:0 risuona a 0,85 ppm insieme al resto delle catene di acrile grasso. Secondo le equazioni mometriche proposte, l’acido linolenico può essere conteggiato come AF a catena corta, aumentando falsamente il contenuto di AF a catena corta delle miscele MF con altri grassi/oli. Il problema diventa serio perché il metodo riportato gioca un ruolo chiave nella rilevazione dell’adulterazione. Il presente lavoro mirava a discutere i limiti della spettroscopia 1H-NMR per la determinazione del FAP dei prodotti lattiero-caseari, con enfasi sugli scenari di adulterazione. Dall’ipotesi che solo i protoni terminali metilici della frazione butirrica risuonino a 0,96 ppm, la FA a catena corta non può essere determinata come classe. Inoltre, poiché i segnali marcatori di moieties butirriche e linoleniche si sovrappongono a 0,96 ppm, queste specie non possono essere determinate in modo indipendente, e quindi possono essere fuorvianti in approcci di individuazione delle frodi. Quindi, la novità del nostro studio è tale: (1) valutare i metodi 1H-NMR precedentemente segnalati per determinare il FAP dei grassi da latte, sottolineando i loro limiti e gli aspetti forse fuorvianti in questioni di autenticità, (2) mettere in evidenza le debolezze di un metodo precedentemente segnalato, applicandolo su miscele sintetiche di grassi non latticini che simulano la composizione del grasso di burro (BF), portando a un errore di classificazione del campione come grasso di latte genuino, e (3) proporre nuovi descrittori di grasso 1H-NMR basati su vari rapporti integrali di segnali associati alla frazione CH2 rispetto ai segnali associati al butirrico e all’FA n-3, che possono essere utili negli approcci all’autenticità. Pertanto, i nostri risultati riportati sono utili nell’area di controllo degli alimenti per valutare l’autenticità dei prodotti lattiero-caseari e per rilevare frodi. 

Abstract

Questo documento ha esaminato i limiti del l’attuale approccio per la determinazione del profilo degli acidi grassi dei grassi del latte a partire da dati di risonanza magnetica nucleare protonica, basandosi sul l’ipotesi che il segnale a 0,96 ppm, attualmente assegnato in letteratura come marcatore per la “acidi grassi a catena corta”, è generato solo dalla frazione butirrica (non da tutti gli acidi grassi a catena corta, che comprendono anche acido C6:0-caproico). L’ipotesi è stata testata e sperimentalmente confermata. Inoltre, la tripletta a 0,96 ppm può anche essere dovuta ad acidi grassi n-3 come l’acido linolenico (C18:3); pertanto, una metodologia precedentemente riportata per la profilatura degli acidi grassi dei prodotti lattiero-caseari, considerata generale in letteratura, non può essere utilizzata nella frodemetodi di rilevazione in quanto consentono di confondere l’acido linolenico con l’acido butirrico, determinando di conseguenza un errore di classificazione dei campioni adulterati come non adulterati. A sostegno del nostro parere, abbiamo applicato l’attuale approccio della letteratura per la determinazione della com posizione degli acidi grassi di 3 miscele sintetiche di grassi non lattieri e abbiamo ottenuto composizioni di acidi grassi simili a grassi di latte, tenendo conto della loro erronea classificazione come grassi genuini del latte. Tuttavia, in realtà, le miscele avevano composizioni molto diverse, come confermato dalla gascromatografia. Di conseguenza, abbiamo evidenziato le debolezze della metodologia esistente per l’individuazione dell’adulterazione degli alimenti a base di latte. In cambio, sono stati proposti nuovi descrittori di risonanza magnetica nucleare protonica basati su vari rapporti integrali di segnali associati alla frazione CH2 rispetto ai segnali associati agli acidi grassi butirrici e n-3 per rilevare le adulterazioni.

 

When detection of dairy food fraud fails: An alternative approach through proton nuclear magnetic resonance spectroscopy

Anamaria Hanganu 1,2 e Nicoleta-Aurelia Chira 3*

  1. Faculty of Chemistry, Department of Organic Chemistry, Biochemistry and Catalysis, Research Centre of Applied Organic Chemistry,  University of Bucharest, Bucharest, Romania.
  2. Institute of Organic Chemistry “C.D. Nenitescu” of the Romanian Academy, Bucharest, Romania.
  3. Faculty of Applied Chemistry and Materials Science, “C. Nenitescu” Organic Chemistry Department, University “Politehnica” of Bucharest, Bucharest, Romania.

J. Dairy Sci. 104 – 27 febbraio 2021. DOI: doi.org/10.3168/jds.2020-19883