Uno studio ha valutato l’influenza dei trattamenti termici per calore (HTST) sulle proprietà chimico-fisiche della lattoferrina bovina applicati ad alimenti per lattanti.

La lattoferrina (LF) è una glicoproteina legante il ferro presente nel latte della maggior parte delle specie di mammiferi. Nel latte bovino maturo, la LF è presente in concentrazioni variabili, in genere da 0,01 a 0,1 g L1, valore spesso più elevato nel colostro e durante gli stati infiammatori. Strutturalmente, la LF consiste in una singola catena polipeptidica di 689 aminoacidi con 1-4 glicani attaccati e presenta differenze interspecie. La LF bovina presenta quattro glicani legati all’N, posizionati a livello di Asn 233, 368, 476 e 545. È stato riportato che la glicosilazione non ha un impatto significativo sulla stabilità termica della LF e il suo contributo è considerato trascurabile in seguito. La catena polipeptidica di LF è ripiegata in due lobi omologhi, uniti da un’elica a tre giri, sensibile alla proteolisi.

I lobi sono denominati “N-” e “C-“ (in riferimento ai punti terminali N- e C- della catena) e possono essere ulteriormente suddivisi in sottodomini noti come N1, N2, C1 e C2. Ogni lobo ha la capacità di legare reversibilmente un singolo ione ferrico (Fe3þ) con una costante di dissociazione (Kd) di 1020 M. Il sito di legame del ferro sulla LF è comune a tutte le specie e coinvolge quattro catene laterali di amminoacidi (il gruppo imidazolico dell’istidina, il gruppo carbossilato dell’acido aspartico e gli ossigeni fenolici di due residui di tirosina). L’insieme di questi elementi fornisce tre cariche negative per legare uno ione Fe3þ, mentre la catena laterale positiva di un residuo di arginina permette il legame bidentato di un anione bicarbonato. Il legame con il ferro porta a una conformazione chiusa e più compatta della fessura, con conseguente aumento della stabilità molecolare della LF. I residui aminoacidici esatti coinvolti nel legame del ferro da parte della LF bovina sono Asp60, Tyr92, Tyr192 e His253 nel lobo N e Asp395, Tyr433, Tyr526 e His595 nel lobo C.

In condizioni acide, la protonazione dello ione bicarbonato permette al ferro di essere rilasciato quando la fessura si apre. Le molecole di LF esistono in una delle tre forme di saturazione del ferro: l’apo-LF è impoverito di ferro, il monoferrico-LF ha uno ione ferrico legato (un lobo saturo), mentre l’olo-LF ha due ioni ferrici legati ed è quindi saturo di ferro. Allo stato nativo, l’LF bovino è una miscela di tutte e tre le forme di legame del ferro ed è solo parzialmente (~15e20%) saturo di ferro. Inoltre, si ritiene che l’entità della saturazione di ferro influenzi il caratteristico colore rosso dell’LF. Anche la temperatura di denaturazione della LF indotta dal calore dipende dallo stato di saturazione del ferro della proteina. Studi che impiegano la calorimetria a scansione differenziale hanno dimostrato che l’LF bovino presenta due picchi di massimo assorbimento di calore, rappresentativi delle sue componenti apo- e olo-componenti. Le temperature esatte riportate per questi picchi variano; gli intervalli di temperatura dei picchi riportati per l’apo- e l’holo-LF sono rispettivamente 60-74 °C e 86-93 °C.

Inoltre, la struttura secondaria dell’LF è influenzata dal trattamento termico; in precedenza sono stati documentati cambiamenti nelle proporzioni relative di a-eliche, b-fogli, giri e strutture non ordinate. La struttura e la stabilità termica dell’LF sono importanti per gli scienziati e i formulatori alimentari che devono prendere in considerazione l’utilizzo dell’LF come ingrediente bioattivo, poiché i cambiamenti della struttura proteica indotti dal trattamento termico possono influire sulle risposte biologiche attese dell’LF. I diversi ruoli biologici associati alle LF sono numerosi, tra cui il trasporto del ferro, le attività antimicrobiche, immunomodulatorie, antiossidanti e antinfiammatorie. Una rassegna riassume la letteratura esistente sull’effetto di vari trattamenti tecnologici (compresa la lavorazione termica) sulle proprietà strutturali e biologiche del LF. Questa pubblicazione evidenzia la necessità di una ricerca che delinei l’impatto fisico-chimico di varie intensità di trattamento termico sui LF, ma che consenta anche un’analisi comparativa dell’impatto degli stessi trattamenti su determinate funzioni biologiche degli stessi campioni di LF.

L’obiettivo del presente studio è stato quello di sviluppare una profonda comprensione fisico-chimica dei cambiamenti indotti dal calore nel LF bovino durante la simulazione di condizioni di lavorazione termica ad alta temperatura e breve tempo, comunemente applicate nella lavorazione industriale di formulazioni nutrizionali come gli alimenti per lattanti. Ci si aspettava che questo lavoro potesse favorire una maggiore comprensione dei legami tra la struttura delle proteine e la funzionalità biologica del LF, che sarà raggiunta attraverso collegamenti con studi successivi. La combinazione di queste nuove conoscenze faciliterà lo sviluppo di strategie per migliorare la protezione della struttura nativa dell’LF, e quindi delle sue funzioni biologiche, al trattamento termico.

Soluzioni acquose di lattoferrina (LF) sono state sottoposte a trattamento termico (72, 80, 85, 95 °C per 15 s) utilizzando un reometro. Nonostante la bassa concentrazione proteica e la bassa forza ionica delle soluzioni di LF, le analisi successive al trattamento hanno rivelato la presenza di aggregati proteici legati in modo covalente indotti dal calore. L’aggregazione è stata accompagnata da un aumento dell’idrofobicità superficiale e del potenziale zeta e da cambiamenti nella struttura secondaria della proteina, tra cui una riduzione della proporzione di domini ad alfa elica e un aumento delle strutture intermolecolari a fogli beta. Il colore rosso nativo della proteina è stato perso con l’elaborazione termica, non attribuibile al rilascio del ferro legato all’LF. La calorimetria a scansione micro-differenziale ha mostrato che la LF è irreversibilmente denaturata al riscaldamento, con endoterme osservate a 58,7 °C (apo-LF) e 89,6 °C (holo-LF). Il trattamento termico a 72e95 °C ha provocato cambiamenti irreversibili nelle proprietà strutturali e fisico-chimiche dell’LF bovino, mentre l’intensità di riscaldamento più bassa ha avuto il minore impatto sulla struttura dell’LF.

La lattoferrina bovina è una proteina termodinamicamente instabile quando viene sottoposta a un trattamento termico simulato ad alta temperatura e breve tempo (HTST). La struttura proteica nativa della LF si dispiega e forma aggregati proteici intermolecolari che per la maggior parte sono legati a disolfuri. Questo processo in due fasi è accompagnato da una progressiva perdita di colore rosso, da un aumento dell’idrofobicità della superficie della proteina, da un aumento del potenziale zeta e da cambiamenti nella struttura secondaria della proteina. Le temperature critiche che avviano la denaturazione della LF dipendono dallo stato di saturazione del ferro delle molecole di LF, poiché la conformazione holo-LF è più stabile della conformazione apo-LF.

Questo lavoro fornisce una profonda comprensione fisico-chimica della sensibilità termica dell’LF, poiché il trattamento termico HTST a 72-95 C ha provocato cambiamenti irreversibili nelle proprietà strutturali e fisico-chimiche dell’LF bovina, mentre l’intensità di riscaldamento più bassa ha avuto un impatto minimo sulla struttura dell’LF. Attualmente sono in corso esperimenti per studiare l’influenza di questi cambiamenti su alcune funzioni biologiche del LF. Ci si aspetta che questo lavoro permetta di comprendere meglio i legami tra la struttura proteica e la funzionalità biologica dell’LF – conoscenze che consentiranno di sviluppare strategie per migliorare la protezione della struttura nativa dell’LF, e quindi delle sue funzioni biologiche, dal trattamento termico.

Il presente articolo è una sinossi della ricerca Goulding, D. A., O’Regan, J., Bovetto, L., O’Brien, N. M., & O’Mahony, J. A. (2021). Influence of thermal processing on the physicochemical properties of bovine lactoferrin. International Dairy Journal, 119, 105001.