Studio sulla ddPCR per rilevare latte bovino nella Mozzarella di Bufala DOP

Una nuova ricerca per combattere le frodi sul Made in Italy. La valutazione riguarda il contenuto di latte bovino all’intento della Mozzarella di Bufala DOP.

INTRODUZIONE

La Mozzarella di Bufala DOP è uno dei prodotti lattiero-caseari italiani più apprezzati all’estero, ed è spesso oggetto di frodi. Il disciplinare della Mozzarella di Bufala prevede che sia prodotta esclusivamente con latte di bufala, ma per massimizzare i profitti spesso i produttori lo uniscono con il latte vaccino che ha un costo nettamente inferiore. Il latte di bufala è infatti più costoso di altri latti di ruminanti, e ha delle caratteristiche reologiche che ne rendono difficile la trasformazione. Ad ogni modo, non è possibile commercializzare una Mozzarella di Bufala con il marchio DOP se è stato inserito del latte non bufalino, e se non ha un minimo del 7.2% in grassi e 4.2% in proteine. È necessario un controllo serrato, perciò, sulle produzioni. La tracciabilità e il controllo biochimico sono necessari a garantire che il consumatore non venga frodato ed a mantenere la qualità del Made in Italy. 

Il metodo ufficiale per rilevare la presenza di latte vaccino all’interno della Mozzarella di Bufala è l’isoelettrofocalizzazione (IEF) delle γ-caseine. Secondo l’attuale Regolamento n. 213/2001, il latte di vacca deve essere inferiore all’1%. In aggiunta all’IEF viene utilizzata anche la cromatografia liquida con rilevazione UV (HPLC-UV) e la procedura del test Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation – Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) per identificare la tipologia di latte, ovvero la sua origine, nei prodotti lattiero-caseari. Attualmente per rilevare le frodi si utilizza anche la PCR. Dato che queste tecniche sono anche influenzate dalle condizioni fisiologiche (mastiti) e non (processi tecnologici), è utile utilizzarle in modo combinato. 

Tra i differenti metodi basati sulla PCR una tecnologia sensibile e diretta è la droplet digital Polymerase Chain Reaction (ddPCR), che individua gli acidi nucleici di interesse. Diversamente dalla real-time PCR (qPCR), la ddPCR accerta la concentrazione assoluta senza richiedere una curva di calibrazione, rendendo così la metodologia più veloce, più precisa e riproducibile. 

Questo studio si pone l’obiettivo di sviluppare e valutare una tecnica ddPCR in grado di rilevare il DNA vaccino nella Mozzarella di Bufala DOP, e comparare i risultati con quelli resi dalle metodologie qPCR, IEF e HPLC-UV.

METODI E MATERIALI

Sono state selezionate 33 mozzarelle di bufala etichettate DOP: 20 provenienti da aziende che svolgono controllo autonomo, e 13 con monitoraggi ufficiali condotti dalla Regione Campania. Tutti i campioni sono stati sottoposti a PCR, qPCR, ddPCR, IEF e HPLC-UV. In aggiunta, sono state prodotte mozzarelle con il 100% latte vaccino e il 100% di latte bufalino. Altri campioni standard sono stati prodotti con il 0.1%, 0.5%, 1%, 5% di latte bovino. Sono stati utilizzati anche due metodi di estrazione del DNA per compararli: il kit QIAmp e il kit ION Force Fast. 

La specificità e sensibilità dei metodi PCR, qPCR e ddPCR sono state valutate evidenziando la riproducibilità dei risultati ottenuti, e analizzando le aliquote di DNA estratte dalla mozzarella di bufala consentente differenti frazioni di latte bovino (quelle dallo 0.1% al 5%). 

RISULTATI

I due kit di estrazione del DNA hanno permesso di ottenere una buona resa e qualità del DNA per la PCR e qPCR, mentre per la ddPCR i risultati migliori sono stati ottenuti dall’estrazione con il kit ION Force Fast. Le analisi effettuate con la ddPCR rimarcano una netta distinzione tra i campioni contenenti latte bovino (segnalato dalle gocce blu) e latte Bufalino (segnalato dalle gocce verdi), o con assenza di DNA (gocce grigie). Mentre per i campioni estratti con il kit QIAmp la differenza non è così chiara. Questo permette di affermare che il kit ION Force Fast fornisce una buona resa e qualità del DNA, e la prestazione è ottimale quando abbinato alla ddPCR. 

I risultati hanno mostrato un’evidente maggior sensibilità della ddPCR rispetto agli altri metodi, in quanto è stato notato che questa è adatta a delle rilevazioni più accurate, mentre la qPCR è preferibile nel caso di rilevazioni in cui è richiesta alta efficienza. Questo perché la ddPCR ha un basso valore nella deviazione standard, mentre la qPCR ha un alto valore. 

La metodologia ddPCR è in grado di rilevare piccole quantità di DNA target, anche in presenza di inibitori naturali contenuti nelle matrici. D’altra parte è importante sottolineare che è una metodologia influenzata dalle condizioni fisiologiche e non, questo comporta che i risultati devono essere comparati con quelli di altre analisi. 

CONCLUSIONI

Questo è il primo studio basato sull’applicazione della ddPCR nel rilevamento delle adulterazioni della Mozzarella di Bufala DOP e dimostra che la ddPCR, affiancata da un kit di estrazione preciso, può essere un buon supporto per i controlli ufficiali, anche se richiede un personale ben preparato e dei costi alti rispetto ad altri metodi. 

Ad ogni modo, è stato dimostrato che è un’ottima metodologia per rilevare le frodi, anche laddove la percentuale di latte bovino è molto bassa. Allo stesso tempo, quest’elevata sensibilità impedisce di comprendere se è stata effettuata una frode o se le aliquote sono dovute a contaminazione accidentale. 

Studi aggiuntivi sono necessari per validare questo metodo e renderlo un metodo di routine.

Articolo tratto da Droplet Digital PCR (ddPCR) Analysis for the Detection and Quantification of Cow DNA in Buffalo Mozzarella Cheese

Autori: Anna Cutarelli ¹, Andrea Fulgione ¹ , Pasquale Fraulo ², Francesco Paolo Serpe ³, Pasquale Gallo ³, Loredana Biondi ¹, Federica Corrado ¹, Angelo Citro ⁴ and Federico Capuano ¹

Animals, 26 marzo 2021.

DOI: doi.org/10.3390/ani11051270